通用要求

1. “如采用已建株的细胞系/株，应具有细胞来源的证明资料。应从能够提供初始细胞历史及其溯源性书面证明材料的机构获得，且应提供该细胞在该机构的详细传代记录，包括培养过程中所使用的所有生物原材料的详细信息，如种类、来源、批号、生产日期及有效期、制备或使用方法、质量标准及检测结果等。如某些信息无法获得，除可提供充分的相关检测数据支持外，不可使用该细胞进行生产。”

解读：在一些特殊情境下（如资料遗失），若部分信息无法获得。可以通过充分的检测数据来支撑。

2.“删除检定用细胞内容”

解读：删除了检定用细胞内容，并不意味着对检定用细胞不再做要求，这部分内容后续会单独成章，但截止目前对应通则还未发布公示，需继续关注。

3.“传代细胞需根据细胞系的特点选择体外细胞龄计算方式。传代细胞的体外细胞龄可采用细胞群体倍增水平或传代水平计算。

根据细胞稳定性研究数据确定生产用细胞龄。限制在细胞寿命期限的前 2/3 内。

连续传代细胞系的细胞龄可以群体倍增时间计算，也可以按照固定的方式传代，如固定比率进行传代，每传 1 次视为 1 代，或按固定培养天数计算。”

解读：参考国际要求，放宽了细胞龄计算方式。对于在封闭环境持续培养情景下也可以按固定培养天数来计算细胞龄。需注意传代稳定性研究时的细胞龄计算方式与实际计算方式要保持一致。

4.“生产用细胞库通常为二级库，包括主细胞库（MCB）及工作细胞库（WCB）。如有细胞种子，也应纳入管理。”

解读：若有细胞种子，也需纳入细胞库的管理并进行检定。明确了细胞种子必须检测的项目：细胞鉴别（细胞身份以及有无其他细胞交叉污染，如同工酶、DNA条形码、细胞种属PCR、STR等）；细菌、真菌检查；支原体检查（指示细胞法+培养法）；内、外源病毒污染检查-体外不同指示细胞培养法。

5. “取细胞种子通过规定的方式进行传代、增殖后，在特定倍增水平或传代水平同次均匀地混合成一批，定量分装于一定数量的安瓿或适宜的细胞冻存管，保存于液氮或-130℃以下，经全面检定合格后， 即可作为主细胞库，用于工作细胞库的制备，生产企业的主细胞库应限定代次并检定合格。最多不得超过两个细胞代次。”

解读：允许连贯建立主细胞库和工作细胞库之后再检定；放宽了细胞库代次要求，但是需要限定在固定的代次或范围。范围较大的话需要评估影响。

6. “每种细胞库均应分别建立台帐，详细记录放置位置、容器编号、分装及冻存数量、取用情况等。细胞库中的每支细胞均应可追溯其具有细胞系/株名、代次、批号、编号、冻存日期，贮存容器的编号等信息。” 

解读：每支冻存管上标识可以采用灵活的方式进行信息溯源，如条形码等；考虑储存容器有可能发生变化，不再强制要求贮存容器的编号信息。

7. “为保证细胞冻存后仍具有良好的活力，冻存前的细胞活力应不低于 90%，冻存后应取一定量的可代表冻存全过程的冻存管复苏细胞，复苏后细胞的活力一般应不低于 80%。若复苏后细胞活力低于 80%，应进行充分评估并有验证数据支持。二倍体细胞冻存后，应至少做一次复苏培养并连续传代至衰老期，检查不同传代水平的细胞生长情况。细胞冻存后，可通过定期复苏细胞及复苏后细胞的活力数据确认验证细胞在冻存及贮存条件下的稳定性。”

解读：随着细胞治疗产品种类越来越丰富，部分细胞冻存前的细胞活率按照≥90%要求过于严格，所以放宽了冻存细胞的活力要求。

8. “细胞检定的基本要求见表1。细胞库建立后应至少对 MCB 细胞及生产终末细胞（EOPC）进行一次全面检定。当生产工艺发生改变时，经变更应重新对 EOPC进行检测。每次从 MCB 建立一个新的 WCB，均应按规定项目进行检定。应对细胞来源、培养及建库过程进行风险评估，并制定检定策略。通常应至少对 MCB 细胞及生产终末细胞（EOPC）进行一次全面检定，工作库进行部分检定。如对主库不能进行全面检定，可对首个工作库进行全面检定，后续建立的工作库可通过评估后进行部分检定。当生产工艺发生变更时，需经评估，必要时应重新对 EOPC 进行检测。”

解读：一些细胞治疗产品管线（如干细胞）的主细胞库数量有限，提供进行全检的样品量存在一定的挑战。可以转到首个工作库进行一次全面检定作为替代。

9.“细胞形态观察及血吸附试验”

解读：删除了内、外源病毒污染检查中的这一项，与国际要求保持一致。但是在病毒类制品生产时的生产对照细胞中需检测该项目。

10.“MCB细胞、WCB细胞新建细胞系/株、细胞库(MCB 和 WCB)和生产终末细胞或生产限定代次细胞应进行鉴别试验，以确认所用细胞正确为本细胞，且无其他细胞的交叉污染。重组细胞系的专属特性的鉴别，还应通过检测目的蛋白基因或目的蛋白进行鉴别试验。细胞鉴别试验方法有多种，包括细胞形态、生物化学法(如同工酶试验)、免疫学检测(如组织相容性抗原、种特异性免疫血清)、细胞遗传学检测(如染色体核型、标记染色体检测)、遗传标志检测[如 DNA 指纹图谱,包括短串联重复序列（STR）、限制性片段长度多态性（RFLP-PCR）和内含子多态性（EPIC-PCR）法等]以及其他方法（如杂交法、PCR 法、报告基因法等）。应至少选择上述一种或几种方法对细胞进行种属和细胞株间及专属特性的鉴别。种属鉴别可依法检查（通则3430）。”

解读：明确了EOPC也需要进行鉴别试验。细胞鉴别的不同方法有各自的特点和局限性，所以通常需要结合使用，来确认细胞身份正确，有无其他细胞的交叉污染。如HEK293T细胞，通过同工酶/细胞种属PCR/DNA条形码检测种属信息是否正确，有无其他种属细胞交叉污染，通过STR检测是否为单一个体来源，有无种内细胞系交叉污染，通过检测腺病毒E1A序列及SV40大T抗原来进一步确认细胞的身份。对于重组细胞还需要额外进行专属特性的鉴别，可以用全基因组测序来确定。

推出了新的通则3430用于指导细胞种属鉴别替代传统的同工酶方法，该通则收录了2个方法：细胞种属PCR以及DNA条形码。如已知供试品的细胞种属信息且在多重 PCR法可检测的种属范围内，可选择多重 PCR 法进行鉴别并判定是否存在其他种属来源细胞的交叉污染；如供试品为未知样本，可选择 DNA 条形码法进行检测，根据序列比对结果确定细胞种属。

11. 细菌、真菌无菌检查取混合细胞培养上清液和或冻存细胞管样品，依法检查（通则 1101），应符合规定。对于 MCB 及 WCB 培养物，至少取混合细胞培养上清液 10 ml，尽可能采用薄膜过滤法检测。对于冻存管细胞，至少取冻存管细胞总支数的 1%或至少 2支冻存细胞管（取量大者），可采用直接接种法检测。

解读：“或”改成了“和”，要求天差地别。需要同时检测混合细胞培养上清液和冻存细胞管。对应检测方法通则1101也进一步与国际接轨，FTM培养基可以不用再置于2个不同的温度培养。

12. 分枝杆菌检查取至少 107个活细胞用培养上清液制备细胞裂解物，按照无菌检查法（通则1101）进行分枝杆菌检查。取细胞裂解物接种于适宜的固体培养基（如罗氏培养基或 Middlebrook 7H10 培养基），每个培养基接种 1mL 并做 3 个重复，并同时以不高于 100CFU 的草分枝杆菌菌液作为阳性对照。将接种后的培养基置于 37℃培养 56 天，阳性对照应有菌生长，接种供试品的培养基未见分枝杆菌生长，则判为合格。

用于外源病毒检测的豚鼠接种法也可检测分枝杆菌，按表 2 所列方法进行试验和观察。豚鼠在注射前应观察 4 周，结核菌素试验为阴性者方可用于试验，观察期末应进行结核菌素试验，并剖检观察主要脏器是否有结节形成。结核菌素试验为阴性，主要脏器无结节，则为符合要求。

解读：无菌检查法（通则 1101）实际上并不适用于分枝杆菌检查，取消关联通则1101；与国际要求一致，根据3R原则，减少动物的使用，所以删除使用豚鼠体内接种检测分枝杆菌的方法建议。

13. “体外不同指示细胞接种培养法检测病毒因子

用细胞培养上清制备活细胞或细胞裂解物作为待测样本，分别接种至少下列三种指示细胞，包括猴源细胞、人二倍体细胞和同种属来源的细胞。对于昆虫细胞，还应至少增加两种敏感的指示细胞进行检测，一种为对虫媒病毒易感的蚊子细胞，也可使用 BHK21 细胞。另一种为对多种昆虫病毒易感的细胞，如果蝇胚胎来源细胞。细胞裂解物应采用细胞悬液或用培养细胞后的上清重悬细胞样本制备。待测样本检测前，可于-760℃或以下保存。

每种单层指示细胞至少接种 107个活细胞或相当于 107个活细胞的裂解物。接种量应占维持液的 1/4 以上，每种指示细胞至少接种 2 瓶。取培养 7 天的细胞各 1 瓶，取上清液或细胞裂解物再分别接种于新鲜制备的相应的指示细胞盲传一代，与初次接种的另一瓶细胞继续培养 7 天，接种细胞后应至少培养 28 天，期间可至少传代一次，但传代时间距观察期末不得少于７天，可将细胞培养物裂解后再接种于新鲜制备的指示细胞，或直接传代。观察细胞病变，并在观察期末取细胞培养物进行血吸附试验；取细胞培养上清液进行红细胞凝集试验。如只能使用悬浮或半悬浮细胞（如昆虫细胞）作为指示细胞时，可仅进行红细胞凝集试验。

分别用 0.2%~0.5% 豚鼠红细胞、和鸡红细胞悬液或混合红细胞悬液混合悬液进行血吸附试验和红细胞凝集试验。将混合红细胞悬液加入细胞培养容器瓶，一半置于 2~8℃孵育 30 分钟，一半置于 20~25℃孵育 30 分钟，分别进行镜检，观察红细胞吸附情况。取细胞上清液从原倍起进行倍比稀释后，加入混合红细胞，先置 2~8℃孵育 30 分钟，然后置于 20~25℃孵育 30 分钟，分别观察红细胞凝集情况。新鲜红细胞在 2～8℃保存不得超过 7 天, 且溶液中不应含有钙、镁离子。接种的每种指示细胞不得出现细胞病变，血吸附试验及红细胞凝集试验均应为阴性。试验应设立病毒阳性对照，包括可观察细胞病变的病毒阳性对照、血吸附阳性对照及血凝阳性对照。如待检细胞裂解物对指示单层细胞有干扰，则应排除干扰因素。

若已知待检细胞可支持人或猴巨细胞病毒(CMV)的生长，则应在接种人二倍体细胞后至少观察 28 天，应无细胞病变，且血吸附试验及红细胞凝集试验应均为阴性。”

解读：该项目技术规范总体与国际要求接轨，具体体现在以下几点：      

①样品暂存稳定由“-70℃以下”调整为“-60℃以下” 

②指示细胞培养时间统一增加至28天，培养期间可以传代，但是限制了传代时间距观察期末不得少于7天。

③规定了新鲜红细胞的暂存条件和配置要求：在2-8℃储存不超过7天；溶液中不应含有钙、镁离子。

④进行血吸附试验和血凝集试验时既可以使用混合的豚鼠红细胞和鸡红细胞进行也可以分别使用对应红细胞单独进行。

⑤对于只能使用悬浮或半悬浮指示细胞检测时，可以仅进行红细胞凝集试验，而不再硬性要求做血吸附试验。

14. “动物体内接种法检测外源病毒因子

“根据细胞的传代历史、生产工艺及检测策略进行风险评估，确定是否进行动物体内接种法检测。如进行动物体内接种法检测，应至少接种乳鼠、成年小鼠和鸡胚，如有必要，可增加豚鼠或家兔体内接种。

用待检细胞培养上清液制备活细胞（或适宜时采用相当量的细胞裂解物），接种动物体内进行外源病毒因子检测。待检细胞至少应接种乳鼠、成年小鼠和鸡胚(两组不同日龄)共计 4 组，如为新建细胞，还需接种豚鼠。原代猴肾细胞还需用家兔体内接种法或兔肾细胞培养法检查猴疱疹 B 病毒。按表 2 所列方法进行试验和观察。接种后 24 小时内动物死亡超过 20%，试验无效。

①经尿囊腔接种的鸡胚，在观察末期，应用豚鼠和、鸡红细胞混合悬液或混合红细胞悬液进行直接红细胞凝集试验。

c.根据风险评估结果确定是否进行体内实验，如在建库或细胞培养过程中存在外源因子引入的风险，可进行体内实验或用经验证的 NGS 法替代。”

(8)分子生物学方法分子生物学方法包括核酸扩增（NAT）法和二代测序（NGS）法。NAT 法，如 PCR 法，可用于特定的病毒检测。NGS 法适用于广谱和特定的病毒检测。基于风险评估结果，广谱的NGS 法可用于替代体内法，也可用于补充或替代体外法（如缺少病毒易感细胞或样品对检测存在干扰或毒性）。 

应使用合适的参考物质对 NGS 法进行方法验证或确认。病毒标准物质应由不同特性的病毒组成，包括不同物理特性（大小，有/无包膜）、不同化学特性（低、中和高抗性）及不同基因组特性（DNA 或 RNA，双链或单链，线性或环状）。NGS 的验证或确认应支持其预期用途，当作为替代方法时，包括方法验证及样本适用性确认。当作为补充方法时，包括方法的确认和样本适用性确认。方法验证参数至少应包括专属性、病毒检测范围及灵敏度，并预先设定可接受标准。

 对 NGS 阳性结果应进一步确认检测到的核酸是否与感染性病毒相关。”

解读：鸡胚尿囊液血吸附试验中使用的红细胞悬液既可以混合做也可以分开分别做。不同动物不同的接种途径对应不同范围的非特定病毒检测，此次变更明确了豚鼠和家兔为非必检动物，可以根据相对应的敏感病毒污染风险评估是否有必要进行接种。同时与ICH Q5A R2 接轨，可以接受经验证的NGS法替代动物体内接种法检测外源病毒。但检测外源病毒污染的NGS方法目前没有标准的方法，若出现假阳性需要进一步分析确定细胞库是否有感染能力的病毒存在，所以也新增了板块对NGS方法学开发和验证进行要求。从目前规定上看，并不建议用NGS方法替代体外不同指示细胞法检测非特定病毒。

15. “逆转录病毒及其他内源性病毒或病毒核酸的检测

透射电镜检查法 取至少 1×107个活细胞采用超薄切片法对至少 200 个细胞进行透射电镜检查观察。

感染性试验 将待检细胞感染逆转录病毒敏感细胞，培养后检测。根据待检细胞的种属来源，须使用不同的或多种的敏感细胞进行逆转录病毒感染性试验。如 Mus dunni 细胞用于鼠逆转录病毒的检测，SC-1 细胞用于亲嗜性逆转录病毒的检测，人源细胞系用于昆虫逆转录病毒的检测等。终点检测方法可选择 PERT试验、S+L-实验或 XC 空斑试验等。

已知产生逆转录病毒的细胞，如啮齿类动物来源的细胞、昆虫细胞及禽源性细胞，可不进行逆转录酶活性检测，但应进行逆转录病毒颗粒的类型、数量及感染性的检查。 ”

解读：与 WHO TRS 978中要求一致，明确透射电镜法需要检查的细胞数量为至少 200个 ；提供了部分敏感指示细胞以及终点检测方法的示例。对于一些已知产生逆转录病毒的细胞如CHO细胞、SF9细胞等，明确了不用再检测逆转录酶活性，可以节约企业检测成本。

16. “种属特异性外源病毒因子的检测

应根据细胞系/株种属来源、组织来源及供体健康状况等确定检测病毒的种类。若在 MCB 或 WCB 中未检测到种属特异性病毒，后续过程中如无引入风险，不再进行重复检测。 鼠源的细胞系，可采用小鼠、大鼠和仓鼠抗体产生试验（MAP、RAP 及 HAP）或经验证的分子生物学方法检测其种属特异性病毒。

猴源细胞系/株应考虑检测猴多瘤病毒（如 SV40）、猴泡沫病毒（SFV）、猴免疫缺陷病毒（SIV）、猴逆转录病毒（SRV）、猴 T 细胞嗜淋巴病毒（STLV）等。”

解读：种属特异性外源污染主要由细胞系本身引入，所以通常在主库检测之后不用在EOPC等后续环节继续检测。但是在一些管线（如干细胞等）中，会使用到一些动物源性（如人源、鼠源）的物料，也有可能引入此类风险，则需要根据实际情况进行评估并在关键节点进行检测。鼠源病毒与ICH法规一致，可采用动物抗体产生试验，也可用经验证的分子学检测方法（如Q-PCR）。增加了具体的猴源病毒种类，不过以往中检院会检测除上述5种病毒外还会检测如：食蟹猴多瘤病毒（CPV）、松鼠猴逆转录病毒（SMRV），可以视猴源细胞系具体情况考虑进行增加。

17. “猪源性病毒的检测

如果在生产者建细胞库之前，细胞基质在建立或传代历史中使用了猪源性材料，如猪胰酶，则所建立的 MCB 或 WCB 和（或）超过生产限定水平的细胞至少应检测一次与胰酶来源动物相关的外源性病毒，如包括猪细小病毒和猪圆环病毒或牛细小病毒等。”

解读：在细胞建立或传代过程中，若有引入相关病毒风险则需要进行相应病毒的检测。在猪细小病毒检测基础上增加了猪圆环病毒，删除了牛细小病毒。不过在以往CDE发布的干细胞指导文件中还有要求猪细环病毒1型和2型，建议也同时进行检测。

18. “其他特定病毒的检测

根据细胞的特性、传代历史或生产培养工艺等确定检测病毒的种类。有些细胞仅对某些特定病毒易感，如 CHO 细胞可污染鼠细小病毒，采用上述检测方法无法检出，因此需要采用特定的方法检测，如特定感染试验或分子生物学方法对CHO 细胞进行鼠细小病毒污染的检测等。”

解读：除调整措辞外，增加对鼠细小病毒检测方法的描述。通常采用Q-PCR进行检测的策略，但对于部分细胞或UPB有可能在进行方法使用性验证的时候出现干扰，则推荐增加感染指示细胞过程，终点再进行Q-PCR的检测。

19. “稳定性细胞稳定性通常包括生产稳定性和贮存稳定性。在生产稳定性上，应评估MCB/WCB 与 EOPC或生产限定代次细胞 之间产品的产量和特性的一致性。对于重组细胞，还应评估MCB/WCB 与 EOPC/生产限定代次细胞 之间插入基因的序列、插入位点（如适用）、目的蛋白序列及翻译后修饰的一致性。对于二倍体细胞，从 MCB/WCB 至 EOPC/生产限定代次细胞还应确保细胞的二倍性。在贮存稳定性上，可通过生产中细胞复苏时的活力数据来评估。若长时间未生产，也可按照一定的时间间隔对贮存细胞的活力进行测定来评估。”

解读：新增稳定性单独的板块。明确了细胞库稳定性的检测要求，确保细胞在贮存期间以及限定代次范围内能稳定可靠的生产。涉及传代稳定性的项目一般至少在主库和生产限定代次细胞中检测。对于重组CHO细胞，可以通过全基因组测序检测插入基因的序列、插入位点和插入基因拷贝数；对于ipsc除了全基因组测序外还需要进行全外显子测序。

20. “染色体检查

新细胞建株过程中，每 8~12 世代应做一次染色体检查，在 1 株细胞整个生命期内的连续培养过程中，应至少有 4 次染色体检查结果。每次染色体检查，应从同一世代的不同培养瓶中取细胞，混合后进行再培养，制备染色体标本片。染色体标本片应长期保存或保存电子图像数据，以备复查。应至少随机取 1000 个分裂中期细胞，进行染色单体和染色体断裂、结构异常和染色体数目（包括超二倍体、亚二倍体和多倍体）检查。应至少随机取200 个分裂中期细胞，精细计数染色体数目，进行超二倍体、亚二倍体和多倍体检查以及染色单体、染色体断裂（包括缺失、插入、倒位、易位）、双着丝粒、多着丝粒、环状染色体、染色体交换等结构异常检查。其中至少随机选取至少选择 50 个分裂中期细胞，进行利用G 分带或 Q 分带技术进行核型分析，并进行精细检查染色体结构检查，记录缺失、插入、倒位、易位及环状染色体数目等结构异常，并记录。精细计数中如发现除亚二倍体以外的染色体异常分裂中期细胞，也应进行核型分析做精细检查。

每次染色体检查，应至少随机取 1000 个分裂中期细胞，进行染色体数目、形态和结构检查，并作记录，以备复查。其中至少选择 50 个分裂中期细胞进行显微照相，作出核型分析，并应粗数 500 个分裂中期细胞，检查多倍体的发生率。

每次染色体检查，应从同一世代的不同培养瓶中取细胞，混合后进行再培养，制备染色体标本片应长期保存以备复查。 

可用 G分带或 Q分带技术检查 50个中期细胞染色体带型，并作出带型分析。”

解读：参考国际上要求，调整了最少检测数量的要求，并修改了相应的判定依据。

增加昆虫细胞检定的特殊要求